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本發(fā)明適用于分子定位技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種三維納米分辨定位方法，包括：對物品中的目標(biāo)分子進(jìn)行熒光激發(fā)；采用兩個并行的探測通道進(jìn)行熒光探測，在每個探測通道中，使熒光依次通過一物鏡及一彎曲光柵采用兩個并行的探測通道進(jìn)行熒光探測，在每個探測通道中，使熒光依次通過一物鏡及一彎曲光柵，成像于同一個探測器上的不同區(qū)域或分別成像于不同的探測器上；兩個探測通道對應(yīng)的成像面對應(yīng)于物品中的共軛面錯位分布，間距為1～3μm；采用雙焦面法對圖像進(jìn)行分析，確定目標(biāo)分子的三維定位信息。本發(fā)明將彎曲光柵多焦面并行成像與雙焦面定位法有機(jī)結(jié)合，在突破現(xiàn)有顯微系統(tǒng)景深的同時，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞厚度范圍內(nèi)運(yùn)動分子的三維納米定位和追蹤。

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